INTRODUZIONE

Più di 1.2 milioni di persone al mondo soffrono di patologie renali allo stadio finale frequentemente associate a sindrome uremica, spesso causa di incremento di morbilità e mortalità.

Sebbene la fisiopatologia di questa sindrome non sia completamente conosciuta, l’accumulo di tossine uremiche, fisiologicamente eliminate dal rene, sembra avere un ruolo cruciale [Vanholder, R [1] (full text), 2008]. Le tossine uremiche rappresentano un gruppo eterogeneo di sostanze, compresi i composti organici e peptidi di medio ed alto peso molecolare. [Vanholder, R, 2003 [2]].

L’emodiafiltrazione con reinfusione endogena on-line (HFR) è un metodo dialitico, che combina i processi di diffusione, convezione ed adsorbimento [Wratten ML, 2007 [3]]. Le alte prestazioni del sistema sono legate all’ottimale combinazione tra la permeabilità della membrana e la performance della cartuccia di resina sorbente.

La tecnica di spettrometria di massa Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (SELDI-ToF) è stata recentemente sviluppata  per analizzare e confrontare il contenuto proteico di numerosi campioni biologici in modo rapido e standardizzato [De Bock, M, 2010 [4] (full text)].

Lo scopo di questo studio è stato quello di  di confrontare tre diverse membrane convettive analizzando il profilo proteomico SELDI-ToF di campioni di UF pre-cartuccia prelevati, in tre tempi diversi, durante il trattamento  dialitico.

METODI

Venticinque pazienti dializzati sono stati trattati con tre differenti membrane: polifenilene High Flux (pHF), polifenilene Super High-Flux (pSHF) e Synclear 02 (Sync 02) (Bellco srl, Italia), con coefficienti di Sieving dell’albumina, in soluzione acquosa,  , di 0,002 per il pHF, 0,02 per pSHF e 0,2 per Sync 02. Durante il trattamento si sono registrati i seguenti parametri:  flusso sanguigno  300±35 ml/min, infusione media 12±2 L, durata  media della dialisi di 222±24 minuti. I campioni di UF, raccolti rispettivamente a 30, 60 e 240 minuti, sono stati caricati su chip con superficie cromatografica CM10 (scambio cationico) e analizzati mediante SELDI-ToF-MS per ottenere il profilo proteico nell’intervallo 2-100 kDa. Venti mL di ciascun campione di UF, mescolati con 110 mL di tampone, sono stati caricati  sugli spot dei ProteinChip pre-equilibrati. Ogni campione è stato processato in duplicato. Dopo 45 minuti di incubazione, a T ambiente ed in costante agitazione, le proteine non legate alla superficie dei chip sono state rimosse mediante lavaggi. Un mL di soluzione satura di acido sinapinico in soluzione acquosa allo0,5% di acido trifluoroacetico (TFA) e al 50% di Acetonitrile (ACN), è stato applicato sulla superficie del chip prima della lettura. L’analisi SELDI è stata effettuata con protocolli ottimizzati per bassi (2-30 kDa) ed alti (30-100 kDa) pesi molecolari. Un pool di UF, utilizzato come controllo di qualità (QC), è stato caricato su di uno spot di ogni proteinChip per valutare la riproducibilità durante tutto esperimento.

L’analisi statistica degli spettri di massa ottenuti è stata eseguita utilizzando il software ProteinChip Data Manager 3,0 (Bio-Rad Lab), attraverso il quale i picchi sono stati suddivisi in cluster e per ognuno sono state ottenute le medie delle intensità per le tre membrane e per i tre tempi considerati. Un P-value inferiore a 0.05 è stato accettato come statisticamente significativo.

RISULTATI

Confrontando i profili proteomici di UF a 30 min di dialisi, si osserva che le intensità dei cluster dei picchi a basso peso molecolare sono più alti per la membrana pHF rispetto alle altre due membrane. Al contrario, a 60 e 240 minuti, l'intensità dei cluster dei picchi è diminuita  per la membrana pHF e aumentata per pSHF e Sync 02. Osservando i cluster dei picchi a medio e ad alto peso molecolare la membrana pHF mostra minore efficienza, mentre la membrana Sync 02 mostra la maggiore permeabilità durante tutto il trattamento. La tabella 1 riporta i valori di intensità media e deviazione standard di tre picchi rappresentativi: 11730, 39211 e 66516 Da (rappresentati nel grafico 1).

CONCLUSIONI

Il profiling proteico degli UF con SELDI-ToF-MS ha dimostrato di essere un metodo adatto per analizzare le prestazioni di membrane differenti. I risultati di questo studio dimostrano che, rispetto a pHF e pSHF, la membrana Sync 02 offre una maggiore permeabilità ed efficienza, mostrando il suo potenziale per la rimozione di tossine a pesi molecolari elevati.