INTRODUZIONE

Diversi studi hanno dimostrato l'effetto rigenerativo di cellule staminali di origine midollare in modelli sperimentali di danno renale acuto (AKI). Le cellule progenitrici endoteliali (EPCs) sono in grado di modulare l’angiogenesi e la riparazione tissutale attraverso meccanismi paracrini compresi il rilascio di fattori di crescita e microvescicole (MVs). MVs sono particelle coinvolte nella comunicazione intercellulare attraverso il trasferimento di proteine e diversi subsets di RNA. Abbiamo recentemente dimostrato che MVs derivate da EPCs esercitano un effetto protettivo su AKI ischemica mediante transfer di mRNA e microRNA nei tessuti danneggiati (Cantaluppi V et al, SIN 2011).

SCOPO DEL LAVORO

Gli scopi del presente studio sono valutare:

• l’effetto protettivo di MVs derivate da EPC in vivo in un modello sperimentale murino di AKI tossica e in vitro sul danno di cellule epiteliali tubulari (TEC) indotto da cisplatino; 
• il ruolo di specifici microRNAs trasportati da MVs derivate da EPC in tale effetto protettivo.

MATERIALI E METODI

Isolamento di EPCs da sangue periferico. Separazione MVs per ultracentrifugazione e caratterizzazione per contenuto di proteine e RNA.

Topi SCID trattati come segue: 1) controllo (s.c. sol. fisiologica 0,9%); 2) cisplatino (s.c.12 mg/Kg cisplatino); 3) cisplatino + i.v. 30 μg EPC-MVs; 4) cisplatino + i.v. 30 μg EPC-MVs pretrattate con 1U/ml RNasi. Come controllo, sono state utilizzate MVs ottenute da fibroblasti umani. Analisi istologica, creatinina e BUN nei diversi gruppi sperimentali.

In vitro, su cellule epiteliali tubulari umane (TEC) sono stati eseguiti saggi di apoptosi (TUNEL, ELISA caspasi-3, -8 and -9), RT-PCR array per geni apoptosi con relativa analisi proteica (FACS, western blot) e test funzionali su TEC (internalizzazione albumina e morfogenesi). In esperimenti selezionati, MVs sono state pre-trattate con 1 U/ml RNasi, isolate da EPCs sottoposte a siRNA per Dicer, enzima intracellulare essenziale per la produzione di microRNA, o transfettate con specifico antagomiR-27a.

RISULTATI

MVs generate da EPCs hanno dimensioni comprese tra 60-130 nm, esprimono molecole di adesione e trasportano mRNA e microRNA. Abbiamo identificato 146 microRNA coinvolti nella proliferazione cellulare, angiogenesi e resistenza all’apoptosi incluso miR-27a (Figura 1).

In topi SCID trattati con cisplatino, EPC-MVs riducono la mortalità e conferiscono protezione dall’AKI come attestato dalla riduzione di BUN e creatinina sierica (Figura 2) e dei segni istologici di danno tubulare e apoptosi (Figura 3). Questi effetti protettivi sono specifici per EPC-MVs, dal momento che MVs derivate da fibroblasti sono inefficaci. Il pre-trattamento di MVs con RNasi riduce significativamente il loro effetto protettivo, suggerendo un ruolo rilevante degli RNA trasportati da MVs alle cellule tubulari (Figura 2-3).

In vitro, MVs  riducono l’apoptosi e l'attivazione di caspasi in TEC trattate con cisplatino (Figura 4): l’effetto anti-apoptotico di MVs non viene inibito dal loro trattamento con RNasi o usando MVs rilasciate da EPCs soggette a siRNA Dicer o transfettate con antagomiR diretto verso miR27a (Figura 4). L’analisi genica su TEC trattate con cisplatino mostra che MVs inducono la riduzione di caspasi e molecole pro-apoptotiche (p53, TNF-alpha, TNF-R, Fas, FADD, CD40, TRAIL-R, Bak, Bik) ed il concomitante incremento di geni anti-apoptotici (Bcl-XL, casper, IAP-1), la maggior parte dei quali sono targets di miR-27a (Figura 5). Tali risultati sono confermati a livello proteico, in particolare la riduzione di Fas e l'aumento di Bcl-XL indotto da MVs (Figura 5). Infine, MVs preservano delle caratteristiche funzionali nelle TEC trattate con cisplatino quali l'internalizzazione di albumina, la morfogenesi e l'espressione di markers di differenziazione tubulare quali ZO-1 e megalina in modo RNA-dipendente (Figura 6).

CONCLUSIONI

MVs derivate da EPC proteggono il rene da AKI tossica indotta da cisplatino in topi SCID mediante il rilascio del loro contenuto di RNA nelle cellule tubulari danneggiate.

Il trasferimento di microRNAs trasportati da MVs ed in particolare miR27a contribuisce alla riprogrammazione epigenetica delle TEC danneggiate da cisplatino verso un programma rigenerativo e di inibizione dell'apoptosi.