INTRODUZIONE

Gli esosomi sono frammenti circolari di membrana rilasciati dai diversi tessuti in tutti i fluidi biologici (Figura 1). Essi sono coinvolti nei processi di comunicazione cellulare grazie all’espressione di specifici recettori di superficie e al contenuto di un determinato materiale genetico (soprattutto miRNA o micro-RNA). L’analisi dei marcatori proteici degli esosomi urinari che provengono dalle cellule del nefrone potrebbe rappresentare un utile strumento per la verifica della funzionalità renale. Purtroppo non esiste ancora un metodo d’elezione per l’isolamento degli esosomi dalle urine; Nel presente lavoro si vuole porre a confronto quattro diverse procedure al fine di definire un protocollo per un rapido e efficace isolamento di esosomi urinari e la loro caratterizzazione di marcatori proteici e di miRNA.

PROTOCOLLI

Gli esosomi sono stati isolati da pool di urine normali mediante i seguenti quattro protocolli:

1)ultracentrifugazione (100.000g, 4°C, 1h)

2) concentratore nanomembrana con filtro da 100.000 MWCO;

3) concentratore nanomembrana con filtro da 1.000.000 MWCO;

4) denaturazione di THP con DTT seguito da ultracentrifugazione.

DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE ESOSOMIALE TRAMITE QUANTIFICAZIONE PROTEICA

Dato che la classica determinazione della concentrazione esosomiale attraverso la quantificazione proteica con metodica Bradford ha dato risultati negativi, si è passati ad utilizzare il Nanosight, apparecchio dedicato allo studio delle particelle dal diametro minore al micron e che sfrutta le capacità rilevanti di uno microscopio ottico. In questo modo si è notata un'elevata concentrazione di esosomi nei campioni ottenuti dai protocolli n. 1 e n. 4 (4,7x108 e 3,5x108 esosomi/ml), mentre la resa è risultata scarsa per gli altri due protocolli (Figura 2). Alla fine è stato preferito il protocollo n. 1 perchè il tracciato del contenuto esosomiale risulta più omogeneo (Figura 3). Gli esperimenti illustrati da questo punto in poi sono stati fatti con esosomi isolati con il protocollo n.1.

CARATTERIZZAZIONE PROTEICA TRAMITE CITOFLUORIMETRIA

Dal momento che gli esosomi sono più piccoli del limite inferiore di sensibilità del cito-fluorimetro, l’analisi al FACS è  stata eseguita in seguito ad adsorbimento degli esosomi su biglie di lattice dal diametro di 4μm (Figura 4). In questo modo abbiamo trovato positività per i tipici marcatori esosomiali (CD63, CD9 e CD81), e per un marcatore di cellule progenitrici (CD133) (Figura 5). Gli stessi dati sono stati confermati da una analisi Western Blot.

ANALISI DEL CONTENUTO DI miRNA ATTRAVERSO qPCR

L’RNA estratto dagli esosomi urinari è stato analizzato con il Bioanalyzer, che ha evidenziato una netta prevalenza dei microRNA rispetto a altri RNA. Successivamente è stato identificato un pannello di miRNA che sono noti per avere un ruolo chiave nella difesa, rigenerazione e differenziazione tissutale. La loro analisi quantitativa attraverso qPCR ha rilevato bassissime quantità di miRNA collegati con la auto-rigenerazione e differenziamento di cellule staminali (miR17, miR21) e con la sopravvivenza cellulare (miR126, miR204), mentre ha evidenziato alte quantità di miRNA collegati con la protezione del DNA (miR24) e con la differenziazione cellulare (miR191, miR222) (Figura 6).

CONCLUSIONI

• Il protocollo più adatto per isolare vescicole urinarie è l’ultracentrifuga semplice (protocollo 1) perché garantisce una resa maggiore, in un limite di tempo accettabile.
• La maggior parte delle vescicole urinarie è composta da esosomi. Questo può essere verificato della presenza di un’alta percentuale di classici marker esosomiali.
• La maggior parte del materiale genetico contenuto negli esosomi urinari è costituito da micro-RNA.
• La maggior parte dei miRNA contenuti negli esosomi urinari hanno un ruolo nella protezione del DNA (mir24), e nella proliferazione cellulare (mir222, mir191).

Questi risultati forniscono un sostanzioso contribuito alla comprensione della caratterizzazione degli esosomi provenienti da urine normali, e rappresentano un utile punto di partenza per il confronto con esosomi provenienti da urine di diversi modelli patologici.