Introduzione. Gli esosomi sono microvescicole coinvolte nei processi di comunicazione cellulare grazie all’espressione di recettori di superficie e al contenuto in materiale genetico. Essi sono rilasciati nelle urine dalle cellule del nefrone, e potrebbero rappresentare utili biomarcatori. Con questo studio si vuol definire un protocollo per l'isolamento di esosomi urinari e la caratterizzazione di marcatori proteici e di micro-RNA.

Metodi. Gli esosomi sono stati isolati da pool di urine normali mediante quattro protocolli: 1) ultracentrifugazione (100.000g, 4°C, 1h); 2) concentratore nanomembrana Amicon-100k; 3) concentratore nanomembrana Vivaspin-500 (Sartorius); 4) denaturazione di THP con DTT seguito da ultracentrifugazione. La quantificazione delle proteine esosomiali è stata eseguita con Bradford e Nanosigh, l’analisi dei miRNA attraverso RT-PCR quantitativa. Dal momento che gli esosomi sono più piccoli del limite inferiore di sensibilità del citofluorimetro l’analisi citofluorimetrica è stata eseguita dopo adsorbimento degli esosomi su biglie di lattice.

Risultati e Conclusioni. L’analisi col NanoSight ha mostrato un'elevata concentrazione di esosomi nei campioni ottenuti dai protocolli n.1-2 (4,7x10E8 e 3,5x10E8 esosomi/ml), la resa è risultata scarsa per gli altri due protocolli. Gli esososomi sono stati caratterizzati per un pannello di diversi miRNA e un test citofluorimetrico ha identificato la presenza dei classici marcatori esosomiali, nonché dei marcatori delle cellule renali. Infine confrontando il contenuto di esosomi di urine normali e di pazienti con trapianto renale è stata rilevata una differenza nell’espressione di marker relativi alla rigenerazione tubulare e vascolare

In conclusione, i risultati indicano che il protocollo basato sull’ultracentrifugazione è il più adatto per l’isolamento di esosomi urinari e che il conteggio degli esosomi con NanoSight è più affidabile della stima attraverso Bradford probabilmente a causa di una contaminazione da proteine urinarie. Inoltre abbiamo identificato marcatori di superficie coinvolti nel processo di esocitosi, ed un gruppo di miRNA che potrebbero rivelarsi importanti nella fisiologia delle cellule renali. Questi risultati possono essere un valido punto di partenza per ulteriori studi in un'ampia varietà di patologie renali.