Principali meccanismi di riassorbimento del NaCl e loro localizzazione lungo il nefrone
Nonostante tutto, c’è sempre qualcuno non soddisfatto della performance del tubulo prossimale…
In effetti il riassorbimento del Na+ è estremamente efficace e garantito da numerosi trasportatori di diversa natura molecolare (pompe ioniche ATP-dipendenti, scambiatori, co-trasportatori elettroneutrali, canali ionici selettivi)
Diversità molecolare dei trasportatori espressi da anse di Henle di differente lunghezza e profondità: in rosso aquaporina 1, in verde canale del cloro ClC-K1, in grigio nessun segnale, ingrandimento del riquadro in b. Immunolocalizzazione assistita al computer
Enorme eterogeneità dei trasportatori tubulari renali
Dinamica del riassorbimento tubulare di H2O lungo il nefrone
Il passaggio di una singola molecola di H2O attraverso una aquaporina inducibile nel dotto collettore. La molecola va incontro ad una rotazione guidata da interazioni elettrostatiche durante il transito, presentandosi con l’atomo di O2 e fuoriuscendo con gli H+ per primi
A sin., ricostruzione tridimensionale della relazione tra vasa recta (verde), anse discendenti di Henle (rosso) e dotti collettori (marcati in blu per l’aquaporina inducibile) in “clusters” nella midollare profonda. A dx., 5 clusters primari di dotti collettori marcati per AQP-2 costituiscono un cluster secondario di 31 dotti collettori alla base della midollare interna
Negli ultimi 25 anni sono stati pubblicati migliaia di studi basati sulla coltura di cellule renali (biologia cellulare). Per ovvii limiti di tempo ci occuperemo brevemente delle sole cellule mesangiali e dei podociti (cellule epiteliali viscerali del glomerulo)
Le principali caratteristiche strutturali delle cellule mesangiali
Le principali caratteristiche funzionali delle cellule mesangiali
Caratteristiche colturali delle cellule mesangiali
Immagine del podocita al microscopio elettronico a scansione. I processi di primo ordine circondano le anse capillari, e da essi si dipartono i processi di second’ordine o processi pedicillari (foot processes)
Immagine del podocita al microscopio elettronico a trasmissione. I processi di primo ordine circondano le anse capillari, e da essi si dipartono i processi di second’ordine o processi pedicillari (foot processes), qui visti in sezione frontale sovrapposti alla membrana basale glomerulare tristratificata
Un diagramma disegnato da Wilhelm Kriz sulla stereomorfologia dei processi pedicillari
Una immagine schematica delle principali componenti della relazione processi pedicillari-membrana basale glomerulare-slit diaphragm
Schema della ultrastruttura e principali proteine costitutive dello “slit diaphragm”. FP,processi pedicillari
Proteine specifiche del podocita e/o slit diaphragm che inducono – se mutate – fusione dei processi pedicillari (effacement of foot processes, EFP)
Altre proteine specifiche del podocita e/o slit diaphragm che inducono – se mutate – fusione dei processi pedicillari (effacement of foot processes, EFP)
Localizzazione della nefrina nello spazio tra processi pedicillari adiacenti
Sequenza aminoacidica della nefrina e struttura del tetramero di 4 nefrine, unità di base dei “lipid rafts” dello slit diaphragm
Una micro-TC del gruppo di Tryggvason mostra la posizione transmembrana podocitaria (M) della nefrina, con la testa identificata da particelle di oro colloidale (G) marcato con IgG
Ancora esempi di identificazione e ricostruzione 3D della nefrina nei ponti che collegano i processi pedicillari (FP, verde). Notare i pori compresi tra nefrine adiacenti (P, nero)
In nero, i pori tra molecole di nefrina (P) limitano il passaggio di albumina (Alb) per semplice interazione meccanica (non necessariamente per carica elettrica)
Quanto detto dimostra come le tecnologie di biologia molecolare si prestino brillantemente all’applicazione alla fisiologia renale. Genomica e proteomica attengono ai meccanismi di codifica genetica e di trasformazione in proteine dei messaggi codificati, rispettivamente
Iniziando con la genomica, ricordiamo che il DNA è notevolmente termostabile e resistente a UV, enzimi, etc. quando in configurazione a doppia elica.
In tema di nomenclatura.
Ulteriore nomenclatura in area genomica.
Principi di sequenziamento del genoma.
IL DNA microarray è uno dei più recenti presidi per lo screening veloce di trascritti multipli per un singolo sistema (p.es. cellule tubulari renali o l’intero organo o l’intero genoma umano).
TUNEL è una tecnica istomorfologica di rilevazione di processi di apoptosi nei tessuti o vetrini da cellule in coltura
Tecnologie per silenziare un gene in vivo o in vitro (ovvero ottenere un KO funzionale senza sviluppare un animale transgenico)
Uno dei più potenti strumenti per verificare gli effetti della iperespressione o soppressione di un gene. Possono essere generate colonie di animali transgenici per uno o più geni.
Classica tecnologia di estrazione dell’RNA preliminare alla ricerca della presenza ed espressione di un trascritto in un tessuto (es. glomeruli isolati o preparazioni di tubuli renali)
Classica procedura semiquantitativa per determinare la trascrizione di un dato mRNa in un tessuto, oggi superata dalla RT-PCR
Consolidata procedura quantitativa per la determinazione dell’espressione genica da cellule o preparazioni anche minime di tessuto (p.es biopsie renali)
PCR con trascrizione inversa per amplificazione di RNA
L’ibridazione in situ è una tecnica istomorfologica di localizzazione del trascritto a singole cellule in un preparato istologico o in colture cellulari
Una variante del Northern blotting utilizzando un supporto di nitrocellulosa e una digestione enzimatica cui sopravvive solo l’RNA ibridizzato con un singolo filamento complementare di DNA
Espressione transitoria di un gene in cellule in coltura, in un tessuto, organo o animale da esperimento
Classica tecnica di riconoscimento di una proteina trasferita su nitrocellulosa e identificata mediante anticorpo specifico rilevato con immunoperosidasi o radiomarcato in autoradiografia
Più accurata caratterizzazione delle specie proteiche migrate su gel bidimensionale, isolate e sottoposte successivamente a spettrometria di massa
Microvescicole proteiche rilasciate nelle urine, da dove possono essere isolate per ultracentrifugazione. Singole proteine specifiche di un tipo cellulare renale possono essere riconosciute mediante immunogold (es. aminopeptidasi dal brush-border del tubulo prox., aquaporina-2 dal dotto collettore, NaCl cotrasporto dal tubulo contorto distale, CD9 da cellule epiteliali della papilla
E’ quindi oggi appropriato parlare di “Fisiologia Molecolare”, come già avvenuto per la Biologia, che per prima ha beneficiato delle nuove tecniche di identificazione di geni e proteine implicate nella funzione dei tessuti
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