FAD · DISCNEF15 · FAD Discussioni nefrologiche

Figura 1 di 32.

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Figura 2 di 32.

Alterazioni Emodinamiche - L’aumento di matrice extracellulare determina una graduale occlusione dei capillari glomerulari con conseguente progressiva diminuzione della funzionalità renale.

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Figura 3 di 32.

Alterazioni Biochimiche - L’iperglicemia, determina un aumento di varie citochine e fattori di crescita, tra cui il TGF-beta, che legandosi al proprio recettore determina l’attivazione trascrizionale di vari geni profibrotici.

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Figura 4 di 32.

Criteri Diagnostici - Sebbene i sintomi clinici siano molto caratteristici, ad oggi solo l'osservazione del campione bioptico può escludere la presenza di lesioni diverse dalla Nefropatia Diabetica.

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Figura 5 di 32.

Il danno renale nel paziente diabetico è variegato. Il lavoro di Mazzucco ha identificato varie classi: Classe 1, Classe 2. Classe 3a e Classe 3b.

La Nefropatia Diabetica è solo la Classe 1; la Classe 2 include biopsie di diabetici che non hanno le lesioni istologiche della DN ma un danno prevalentemente vascolare; la Classe 3a è mista in quanto oltre alla DN il danno istologico è anche riconducibile ad altre complicanze (tipo la membranosa, la Nefropatia da IgN, ecc); e poi la Classe 3b nel momento in cui in seguito a biopsia di un diabetico viene riscontrato un danno istologico che non ha nulla a che vedere con la Nefropatia Diabetica.

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Figura 6 di 32.

Caratteristiche Morfologiche delle classi

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Figura 7 di 32.

Caratteristiche morfologiche della DN

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Figura 8 di 32.

I microRNA sono molecole ci RNA-non codificante altamente tessuto-specifiche che regolano l’espressione genica a livello post-trascrizionale. Un microRNA può legare numerosi target. Il legame miRNA/target determina il silenziamento del target (domande ECM).

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Figura 9 di 32.

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Figura 10 di 32.

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Figura 11 di 32.

L’importanza dei miRNA a livello renale venne dimostrata attraverso delezione podocito-specifica dell’enzima DICER (necessario alla biogenesi dei miRNAs). Anche più nello specifico, e quindi in DN, è stato dimostrato come i miRNAs contribuiscano ad alterare l’espressione di proteine coinvolte nei processi di patogenesi. Il profiling dei miRNAs a livello del tessuto renale non è però mai stato condotto su materiale umano.

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Figura 12 di 32.

Obiettivo del nostro lavoro è stato appunto il profiling dei miRNAs a livello del tessuto renale umano. Come materiale di partenza abbiamo utilizzato la porzione avanzante di biopsie renali fissate in formalina.

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Figura 13 di 32.

Tre gruppi di pazienti analizzati: controlli (pazienti con anomalie urinarie il cui tessuto è risultato istologicamente normale); DN (classe 1 Mazzucco); nefropatia membranosa in paziente diabetico (classe 3b Mazzucco)

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Figura 14 di 32.

Il profiling del tessuto renale evidenzia molti miRNAs in comune tra DN ed MN differenzialente espressi rispetto ai controlli.

Ci sono comunque dei miRNAs specifici sia per una classe che per l’altra. Se queste differenze dovessero riflettersi a livello dei biofluidi, la scoperta avrebbe importanti implicazioni a livello diagnostico perchè consentirebbe di bypassare la biopsia.

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Figura 15 di 32.

FOCUS sui DN-miRNAs (sia in comune che non con le MN). Alcuni miRNAs sono anche stati saggiati attraverso la metodica di Real-Time PCR per confermare il risultato dei microarrays. Alcuni dei miRNAs da noi identificati come differenziamente espressi in DN rispetto ai controlli, sono già conosciuti in letteratura per le loro implicazioni nella patogenesi.

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Figura 16 di 32.

FOCUS sui DN-miRNAs (sia in comune che non con le MN). Alcuni miRNAs sono anche stati saggiati attraverso la metodica di Real-Time PCR per confermare il risultato dei microarrays. Alcuni dei miRNAs da noi identificati come differenziamente espressi in DN rispetto ai controlli, sono già conosciuti in letteratura per le loro implicazioni nella patogenesi.

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Figura 17 di 32.

ESEMPIO di WORKFLOW per lo studio sui miRNAs.

Oltre al profiling, che ha di sicuro implicazioni diagnostiche, è importante capire il contributo dei miRNAs in termini di patogenesi e progressione del danno.

Attraverso specifici softwares è possibile predire in silico il numero di target per ciascun miRNA, filtrando ad esempio per i target espressi solo nel rene (ricorda che i miRNA sono tessuto specifici) ed associati a malattie renali. Da questa analisi quantitativa si evince come ad esempio il miRNA-16 abbia molti più target rispetto al miRNA-126.

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Figura 18 di 32.

E’ possibile anche analizzare i target a livello qualitativo. Soffermandoci su quelli validati sperimentalmente, emerge come I target più ricorrenti dei miRNAs indotti in DN siano ben noti in letteratura per il loro ruolo nella progressione. Possiamo quindi affermare che l’induzione di specifici miRNAs in DN determina la repressione di proteine specifiche (es. VEGFA e PTEN).

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Figura 19 di 32.

E’ noto dalla letteratura che sia la riduzione di PTEN che del VEGFA è cruciale in DN

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Figura 20 di 32.

Associando diversi dataset è possibile poi predire nuove interazioni tra miRNA/target. In questo caso abbiamo sfruttato i risultati dell’espressione genica sul tessuto renale di pazienti DN (woroniecka et al), ed abbiamo associato ad essi i nostri risultati sui DN-miRNAs. In questo caso possiamo chiedere al software di fare un’associazione inversa (se il miRNA aumenta, il target predetto deve diminuire e viceversa) e isolare tutti i target altamente predetti tra quelli già noti come deregolati nel tessuto renale DN.

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Figura 21 di 32.

Anche in questo caso possiamo filtrare ad esempio in base al tipo di interazione predetta (forte/debole), al tessuto e/o specie, ecc.

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Figura 22 di 32.

Tra i target ridotti in DN (da woroniecka) e per cui è predetta una forte interazione con I nostri DN-miRNAs, due in particolare hanno catturato la nostra attenzione: MAGI2 e SULF1. Abbiamo deciso quindi di provare a vedere la loro riduzione in DN fosse dovuta a qualche miRNA DN-specifico in particolare.

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Figura 23 di 32.

Per fare gli studi di validazione bisogna utilizare dei sistemi in vitro, quindi abbiamo provato a vedere in primis se l’alto glucosio determinasse (24H) un aumento di qualche miRNA tra quelli indivituati nel tessuto renale. Il miR-140 è tra questi. Aumenta nei reni DN, aumenta anche in podociti coltivati in alto glucosio, ed è cneh aumentato nei reni di topi STZ rispetto ai controlli.

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Figura 24 di 32.

Il miR-140 ha sia MAGI che SULF tra i target predetti, in più ha il VEGFA come target già noto. Inibendo il miR-140 quindi il VEGFA deve aumentare (controllo positivo). Se anche MAGI e SULF aumentano, è molto probabile che anche questi siano target del miRNA. In questo caso si vede come aumenti solo SULF-1.

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Figura 25 di 32.

Attraverso western blotting si ha la conferma che SULF1 è un target del miR-140. Il western blot è una delle metodiche più accreditate per la validazione dell’interazione miRNA/target.

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Figura 26 di 32.

Oltre al western, anche qreal-time PCR e reporter assay sono prova forte di interazione miRNA/target. Isolando solo i target noti dei nostri miRNA DN-specifici, che sono stati simultaneamente validati con tutte e tre qeuste metodiche, emerge un dato interessante. Tra le proteine più ricorrenti emergono le DNA metiltransferasi

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Figura 27 di 32.

Possiamo quindi affermare che I miRNA DN-specifi concorrono alla soppressione delle DNA metiltrasferasi in DN. Questi enzimi regolano l’espressione genica attraverso meccanismi di epigenetica; è stata di recente dimostrata l’importanza dell’epigenetica nei fenomeni ad esempio di memoria metabolica.

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Figura 28 di 32.

Ma cosa determina l’alterata espressione dei miRNAs?

Forse la risposta è sempre nel nostro DNA.

E’ possibile che mutazioni (SNPs) a livello di regioni promotori dei miRNAs determinino un’amentata o ridotta trascrizione degli stessi.

Oppure SNPs a livello dei target determinino una diversa suscettibilità alla interazione miRNA/target e quindi alla malattia

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Figura 29 di 32.

E’ necessario quindi un approccio di systems biology per valutare meglio le interazioni molecolari integrando i vari livelli di informazione

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Figura 30 di 32.

Ci sono vari software che consentono di associare informazioni diverse. Ad esempio con mirSNP è possibile vlutare se esistono SNPs di geni che cadono in regioni di interazione con specifici miRNAs.

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Figura 31 di 32.

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Figura 32 di 32.

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Ruolo dei microRNA nella nefropatia diabetica

Figura 1 di 32.

Figura 2 di 32.

Figura 3 di 32.

Figura 4 di 32.

Figura 5 di 32.

Figura 6 di 32.

Figura 7 di 32.

Figura 8 di 32.

Figura 9 di 32.

Figura 10 di 32.

Figura 11 di 32.

Figura 12 di 32.

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Figura 15 di 32.

Figura 16 di 32.

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Figura 23 di 32.

Figura 24 di 32.

Figura 25 di 32.

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Figura 27 di 32.

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